分子筛（SEC）无疑是许多色谱方法中最精细的存在。高分辨率，高性能的色谱柱对于获得令人满意的实验结果至关重要。刚刚接触过层析成像的小朋友们已经接管了这个精致的支柱。你不觉得有一种心跳加速，没有开始的感觉吗？如何保持如此精致的支柱？别担心，让我们了解一下〜

首次使用建议：

在连接色谱柱之前，请务必确认流路中没有空气！通常，柱子储存在20％乙醇溶液中以避免微生物的增殖，但20％乙醇的粘度高于水溶液的粘度，因此需要降低。流速可防止床被压缩。

  结论是：

将色谱柱连接到系统，确保连接时色谱柱前部的流路中没有气泡;

使用缓冲液置换色谱柱中的酒精时，使用低流速;

如有必要，测试色谱柱的耐压参数（增加系列）;

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刚才我们也提到了效率测量。这个参数是什么？我们应该做什么？

色谱柱效率是测量色谱柱和仪器性能的快速方法。也许你会问，我们一直在谈论专栏，为什么我们提到这个乐器？实际上，仪器管道的厚度为、死体积会对柱效应的结果产生影响，因此，要评估一列的性能，需要相同的仪器是在相同的实验条件下进行的。通常，我们可以使用1％体积的1％丙酮来吸收280nm处的检测。具体操作在每列的手册中详细描述。此外，ÄKTA仪器还可以通过峰值积分快速计算结果。

在实验过程中需要注意哪些方面？

1.低温操作：为了保护蛋白质的稳定性，许多小伙伴选择在低温下进行色谱分析。然后必须提醒您，当溶液冷时粘度会增加，所以一定要降低流速。此外，重要的是要注意所有溶液都保持与色谱柱相同的温度，以避免因温度变化而引入气泡。

2.样品制备：良好的样品是实验成功的第一步。对于分子筛，所有样品必须通过0.22μm过滤器（或10,000 g，10分钟以除去上清液）过滤，以防止颗粒堵塞色谱柱。此外，在实验过程中，必须确保样品在pH值为、的条件下不会变性或聚集和沉淀。如果您需要使用增溶剂（如洗涤剂），请确保在实验过程中同时添加样品、溶液。3.缓冲溶液：分子筛属于非吸附色谱。只需要一个缓冲溶液。它具有很好的兼容性。基本上，我们只需要考虑蛋白质的稳定性来选择合适的缓冲液。通常，我们将在实验中添加150-300mM NaCl以减少非特异性吸附。当使用不同的溶液时，由于溶液本身的粘度不同，请降低流速以保护色谱柱。

4.常规清洁：定期清洁可延长色谱柱的使用寿命并保持良好的分离度。清洁频率与实际条件有关，例如样品和分辨率要求。通常，如果色谱柱顶部有颜色变化，或者色谱柱的背压增加，分辨率降低等，则会提示我们及时清洁色谱柱。对于Superdex和Superose系列色谱柱，通常建议进行反向清洗，Hiprep Sephacryl系列色谱柱通常是向前清洗的。最常见的清洗方法是使用1柱体积的0.5M NaOH（Superdex和Superose系列）或0.2M NaOH（Sephacryl系列），并立即用2柱体积的水和2柱体积的缓冲液平衡，切不要存放NaOH溶液中的色谱柱很长一段时间。

如果常规清洗仍未达到预期效果，可根据残留物选择其他清洗方法：例如：0.5M乙酸溶液，1M NaOH，8M尿素或6M盐酸胍（用于蛋白质沉淀），30％异丙基酒精（对于脂质或疏水性物质，也可以考虑用胃蛋白酶消化（1毫克/毫升，在0.1M乙酸中加入0.117乙酸溶液），然后用NaOH洗涤。

5.储存：如果色谱柱使用时间超过2天，建议用2倍柱体积的水清洗色谱柱，然后用2倍柱体积的20％乙醇冲洗色谱柱。 （Hiload Superdex 30pg和Hiload Superdex 75pg建议在20％乙醇中加入0.2M NaAc以维持pH稳定性）。再次，20％乙醇的粘度比较高，请注意降低流速。如果长时间存放或需要运输，请连接保护装置，以避免因环境变化而引入气泡。

事实上，沸石分子筛的使用并不复杂。只要你大胆耐心，你就能获得良好的实验结果〜