广告位
文章正文
实验结果至关重要:分子筛的使用并不复杂
作者:    发布于:2018-07-12 09:29:26    文字:【】【】【

分子筛(SEC)无疑是许多色谱方法中最精细的存在。高分辨率,高性能的色谱柱对于获得令人满意的实验结果至关重要。刚刚接触过层析成像的小朋友们已经接管了这个精致的支柱。你不觉得有一种心跳加速,没有开始的感觉吗?如何保持如此精致的支柱?别担心,让我们了解一下〜

首次使用建议:

在连接色谱柱之前,请务必确认流路中没有空气!通常,柱子储存在20%乙醇溶液中以避免微生物的增殖,但20%乙醇的粘度高于水溶液的粘度,因此需要降低。流速可防止床被压缩。

  结论是:

将色谱柱连接到系统,确保连接时色谱柱前部的流路中没有气泡;

使用缓冲液置换色谱柱中的酒精时,使用低流速;

如有必要,测试色谱柱的耐压参数(增加系列);

您的专栏已准备就绪

刚才我们也提到了效率测量。这个参数是什么?我们应该做什么?

色谱柱效率是测量色谱柱和仪器性能的快速方法。也许你会问,我们一直在谈论专栏,为什么我们提到这个乐器?实际上,仪器管道的厚度为、死体积会对柱效应的结果产生影响,因此,要评估一列的性能,需要相同的仪器是在相同的实验条件下进行的。通常,我们可以使用1%体积的1%丙酮来吸收280nm处的检测。具体操作在每列的手册中详细描述。此外,ÄKTA仪器还可以通过峰值积分快速计算结果。

在实验过程中需要注意哪些方面?

1.低温操作:为了保护蛋白质的稳定性,许多小伙伴选择在低温下进行色谱分析。然后必须提醒您,当溶液冷时粘度会增加,所以一定要降低流速。此外,重要的是要注意所有溶液都保持与色谱柱相同的温度,以避免因温度变化而引入气泡。

2.样品制备:良好的样品是实验成功的第一步。对于分子筛,所有样品必须通过0.22μm过滤器(或10,000 g,10分钟以除去上清液)过滤,以防止颗粒堵塞色谱柱。此外,在实验过程中,必须确保样品在pH值为、的条件下不会变性或聚集和沉淀。如果您需要使用增溶剂(如洗涤剂),请确保在实验过程中同时添加样品、溶液。3.缓冲溶液:分子筛属于非吸附色谱。只需要一个缓冲溶液。它具有很好的兼容性。基本上,我们只需要考虑蛋白质的稳定性来选择合适的缓冲液。通常,我们将在实验中添加150-300mM NaCl以减少非特异性吸附。当使用不同的溶液时,由于溶液本身的粘度不同,请降低流速以保护色谱柱。

4.常规清洁:定期清洁可延长色谱柱的使用寿命并保持良好的分离度。清洁频率与实际条件有关,例如样品和分辨率要求。通常,如果色谱柱顶部有颜色变化,或者色谱柱的背压增加,分辨率降低等,则会提示我们及时清洁色谱柱。对于Superdex和Superose系列色谱柱,通常建议进行反向清洗,Hiprep Sephacryl系列色谱柱通常是向前清洗的。最常见的清洗方法是使用1柱体积的0.5M NaOH(Superdex和Superose系列)或0.2M NaOH(Sephacryl系列),并立即用2柱体积的水和2柱体积的缓冲液平衡,切不要存放NaOH溶液中的色谱柱很长一段时间。

如果常规清洗仍未达到预期效果,可根据残留物选择其他清洗方法:例如:0.5M乙酸溶液,1M NaOH,8M尿素或6M盐酸胍(用于蛋白质沉淀),30%异丙基酒精(对于脂质或疏水性物质,也可以考虑用胃蛋白酶消化(1毫克/毫升,在0.1M乙酸中加入0.117乙酸溶液),然后用NaOH洗涤。

5.储存:如果色谱柱使用时间超过2天,建议用2倍柱体积的水清洗色谱柱,然后用2倍柱体积的20%乙醇冲洗色谱柱。 (Hiload Superdex 30pg和Hiload Superdex 75pg建议在20%乙醇中加入0.2M NaAc以维持pH稳定性)。再次,20%乙醇的粘度比较高,请注意降低流速。如果长时间存放或需要运输,请连接保护装置,以避免因环境变化而引入气泡。

事实上,沸石分子筛的使用并不复杂。只要你大胆耐心,你就能获得良好的实验结果〜


广告位
插入代码
脚注信息
版权所有 Copyright(C)2002-2016 江西鑫陶科技股份有限公司 网站备案:赣ICP备12002161号-1 技术支持:安源在线
 
访问统计